鼠抗人骨形成蛋白4單克隆抗體實(shí)驗(yàn)操作步驟： 細(xì)胞固定與通透 完成抗體孵育后，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。吸盡液體后加入4%多聚甲醛（PBS配制），室溫固定15分鐘。PBS洗滌3次后，加入0.1% Triton X-100通透液（PBS配制），室溫處理10分鐘以增強(qiáng)膜通透性。注意此步驟需嚴(yán)格控制時(shí)間，過度通透會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。 封閉與非特異性結(jié)合消除 用含5% BSA的PBS封閉液覆蓋樣品，37℃濕盒中封閉30分鐘。對(duì)于高背景樣本，可改用與二抗同源的5%正常血清封閉。封閉后直接進(jìn)行一抗孵育，避免樣品干燥。 一抗孵育優(yōu)化 將鼠抗人BMP-4單克隆抗體用抗體稀釋液（1% BSA/PBS）按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的效價(jià)稀釋（建議起始濃度1:200）。滴加抗體溶液覆蓋樣品，4℃濕盒中過夜孵育可獲得更高信噪比。若采用室溫孵育，需在搖床上輕柔振蕩1-2小時(shí)。 二抗選擇與信號(hào)放大 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇匹配的二抗：熒光標(biāo)記二抗（如FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG）用于免疫熒光，HRP標(biāo)記二抗用于WB。推薦使用經(jīng)過交叉吸附處理的高純度二抗，稀釋比例1:500-1:1000。37℃避光孵育1小時(shí)，PBS-T（0.05% Tween20）洗滌3次，每次10分鐘。如需信號(hào)放大，可選用酪胺信號(hào)放大（TSA）系統(tǒng)。 結(jié)果判讀與質(zhì)控 設(shè)立嚴(yán)格的陰性對(duì)照（空白對(duì)照、同型對(duì)照、二抗對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照（已知BMP-4高表達(dá)細(xì)胞）。使用激光共聚焦顯微鏡觀察時(shí)，注意調(diào)整曝光參數(shù)避免信號(hào)飽和。Western Blot檢測(cè)應(yīng)在還原條件下進(jìn)行，預(yù)期條帶分子量約45kDa。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需經(jīng)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 ?注意事項(xiàng)： 1. 全程避免樣品干燥 2. 不同批次抗體需重新滴定效價(jià) 3. 熒光實(shí)驗(yàn)需避光操作 4. 含疊氮 NA的抗體溶液不得用于活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
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